动态压力对负载胰岛素样生长因子基因兔脂肪间(2) -中国组织工程研究杂志社投稿

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动态压力对负载胰岛素样生长因子基因兔脂肪间(2)

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关键词:

摘要：

1.4.4 形态学观察培养7 d后收集标本，以PBS漂洗两三遍，2.5%戊二醛固定，4 ℃过夜，常规脱水、干燥，表面喷金镀膜，扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长情况以及细胞外基质的分泌，并拍照记录。同时常规固定、包埋、切片，应用Masson三色染色及阿尔新蓝染色观测细胞在支架上的分布情况、软骨胶原以及软骨特异性细胞外基质糖胺聚糖的分泌情况。

1.4.5 MTT法绘制细胞增殖曲线如上所述分组，分别于1，3，5，7 d应用MTT法观察细胞/支架复合物的吸光度值，每组设有3个平行实验，计算各组的平均值，以时间点为X轴，各时间点各组的吸光度值为Y轴，绘制细胞增殖曲线。

1.4.6 CM-Dil荧光染料标记后计数细胞增殖情况按照即用型CM-Dil荧光标记液说明书配制工作液，标记脂肪间充质干细胞，加入完全培养基培养，待细胞80%以上融合后，胰酶消化收集细胞，按上述分组条件接种细胞并施加干预因素。1周后取出样本，冰冻包埋剂常规包埋，冷冻切片，厚度为10 μm，立即置于荧光显微镜下观察细胞分布情况，并拍照记录，随机选取6张切片，100倍镜下选5个视野，计数荧光标记的细胞数，并进行统计学分析。

1.4.7 总糖胺聚糖含量测定应用(1，9)-二甲基亚甲(DMMB)法测定细胞外基质中总糖胺聚糖含量。取出细胞/支架复合物，冷冻干燥后剪碎，加入300 μL木瓜蛋白酶溶液(5 g/L，pH值6.5)，在65 ℃水浴中消化16 h，取250 μL上述孵化消化液加入2.5 mL的DMMB溶液(16 mg/L，pH值为2.0)，5 min后于525 nm波长比色测定吸光度值，制作标准曲线，计算糖胺聚糖含量。标准品为硫酸软骨素。

1.4.8 Real time PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达培养7 d后取各组细胞/支架复合物，以Trizol裂解细胞，提取总RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录操作，然后以第一链cDNA为模板，应用real time PCR 法(两步法扩增程序，20 μL反应体系)定量检测细胞/支架复合物中Ⅱ型胶原基因的相对表达。以GAPDH作为内参，应用2-ΔΔCt法比较各组Ⅱ型胶原基因相对表达水平。引物的设计与合成委托大连宝生物公司完成，反应条件及产物长度见表1。

表1 ｜PCR引物序列及实验反应条件 (n=6)Table 1 ｜PCR primer sequence and experimental conditions?

1.4.9 细胞/支架复合物的机械性能检测各组细胞/支架复合物分别于37 ℃培养条件培养7 d后收集标本，立即应用BioDynamicTMmechanical tester(WinTest 4.0操作系统)检测各组细胞/支架复合物在2.5%-25%弹性形变(频率为10 Hz)时的轴向弹性压力，并计算对应的弹性模量值，并绘制应力、应变曲线。

1.5 主要观察指标 ①RT-PCR及Western blot法检测转染后脂肪间充质干细胞中IGF-1的表达；②细胞/支架复合物组织形态学观察；③MTT法绘制脂肪间充质干细胞在壳聚糖/明胶支架上的增殖曲线，CM-Dil荧光染料标记后计数细胞增殖效率；④DMMB法定量测定细胞/支架复合物中总糖胺聚糖含量；⑤RT-PCR检测细胞/支架复合物中Ⅱ型胶原的相对表达；⑥细胞/支架复合物的弹性模量。

1.6 统计学分析实验数据以±s表示，由第一作者采用SPSS 13.0软件对实验结果进行方差分析和student-Newman-Keuls检验，P＜ 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 RT-PCR及Western blot法检测转染后脂肪间充质干细胞中IGF-1的表达转染48 h后的细胞转染率为30%-40%，进一步经G418筛选，获得稳定表达IGF-1的细胞株，实验证实转染后细胞在mRNA及蛋白水平均获得IGF-1的高表达，而在未转染组及空载体组则无特异性表达，见图1。

2.2 形态学观察结果扫描电镜显示各组细胞生长旺盛，在支架上附着、伸展良好，动态压力培养可明显促进细胞外基质分泌，动态压力联合IGF-1基因转染组的细胞生长最为旺盛，细胞饱满，分布均匀，尤其是在支架的顶部，明显可见密度较高的细胞以及细胞外基质分泌，见图2。

Masson三色染色及阿尔新蓝染色显示IGF-1 +动态压力组的脂肪间充质干细胞生长密度明显高于其他3组，并有更多的软骨胶原和软骨特异性基质(硫酸化蛋白多糖)分泌。在动态压力条件下，细胞生长分布较为均匀，而静态培养条件下，细胞大多分布于支架的表面，见图3，4。

2.3 细胞增殖能力应用MTT法绘制细胞增殖曲线，见图5。从图中可见各组脂肪间充质干细胞生长状态优良，均具备较好的增殖能力；各组脂肪间充质干细胞增殖速度：IGF-1 +动态压力组＞IGF-1组＞动态压力组＞对照组，差异均有显著性意义(P＜ 0.01)。

CM-Dil荧光标记后，再经过各组实验干预因素干预7 d，观察发现静态培养组的细胞多分布于支架材料的四周，中心略差；动态机械压力培养条件下，可见细胞分布均匀一致，见图6。细胞计数结果显示细胞增殖趋势与MTT检测结果一致，见表2。

文章来源：《中国组织工程研究》网址: http://www.zgzzgcyj.cn/qikandaodu/2021/0301/1043.html