胸椎黄韧带骨化患者的差异蛋白组学研究 -中国组织工程研究杂志社投稿

一、稿件要求： 1、稿件内容应该是与某一计算机类具体产品紧密相关的新闻评论、购买体验、性能详析等文章。要求稿件论点中立，论述详实，能够对读者的购买起到指导作用。文章体裁不限，字数不限。 2、稿件建议采用纯文本格式(*.txt)。如果是文本文件，请注明插图位置。插图应清晰可辨，可保存为*.jpg、*.gif格式。如使用word等编辑的文本，建议不要将图片直接嵌在word文件中，而将插图另存，并注明插图位置。 3、如果用电子邮件投稿，最好压缩后发送。 4、请使用中文的标点符号。例如句号为。而不是.。 5、来稿请注明作者署名(真实姓名、笔名)、详细地址、邮编、联系电话、E-mail地址等，以便联系。 6、我们保留对稿件的增删权。 7、我们对有一稿多投、剽窃或抄袭行为者，将保留追究由此引起的法律、经济责任的权利。二、投稿方式： 1、请使用电子邮件方式投递稿件。 2、编译的稿件，请注明出处并附带原文。 3、请按稿件内容投递到相关编辑信箱三、稿件著作权： 1、投稿人保证其向我方所投之作品是其本人或与他人合作创作之成果，或对所投作品拥有合法的著作权，无第三人对其作品提出可成立之权利主张。 2、投稿人保证向我方所投之稿件，尚未在任何媒体上发表。 3、投稿人保证其作品不含有违反宪法、法律及损害社会公共利益之内容。 4、投稿人向我方所投之作品不得同时向第三方投送，即不允许一稿多投。若投稿人有违反该款约定的行为，则我方有权不向投稿人支付报酬。但我方在收到投稿人所投作品10日内未作出采用通知的除外。 5、投稿人授予我方享有作品专有使用权的方式包括但不限于：通过网络向公众传播、复制、摘编、表演、播放、展览、发行、摄制电影、电视、录像制品、录制录音制品、制作数字化制品、改编、翻译、注释、编辑，以及出版、许可其他媒体、网站及单位转载、摘编、播放、录制、翻译、注释、编辑、改编、摄制。 6、投稿人委托我方声明，未经我方许可，任何网站、媒体、组织不得转载、摘编其作品。

胸椎黄韧带骨化患者的差异蛋白组学研究

作者:

关键词:

摘要：

0 引言 Introduction

黄韧带骨化是脊柱韧带的一种病理性异位骨化性疾病，由纤维组织转化成骨性组织的过程。有黄韧带附着的脊柱部位均可发生，其中尤以T10-T12发病率最高[1-2]。胸椎黄韧带骨化是引起胸椎管狭窄及脊髓卡压的最常见原因[3]，其进一步发展也可导致脊髓损伤，甚至发生截瘫，从而给患者带来严重的后果。目前手术是治疗该疾病的唯一方法，早期筛查和诊断胸椎黄韧带骨化并提前做出预防对于患者的诊治非常重要。

目前胸椎黄韧带骨化发病相关机制主要集中在转录组及基因组水平研究，先前有研究表明氟中毒、遗传背景、饮食习惯、代谢异常、机械应力及炎症等因素与胸椎黄韧带骨化发病有关[4-8]，但胸椎黄韧带骨化的病因及发病机制仍不清楚。与很多疾病一样，胸椎黄韧带骨化的疾病过程也被认为与蛋白质的特定定量及功能变化有关。有研究报道通过蛋白质组学可鉴定病理组织的生物标志物[9]。目前蛋白组学在后纵韧带骨化、骨质疏松、强直性脊柱炎、腰椎管狭窄症、骨肿瘤及骨关节炎等骨相关疾病中研究报道[10-15]。蛋白组学在胸椎黄韧带骨化中研究甚少，极少有研究报道，虽然WANG等[2]、姜宇等[16]对胸椎黄韧带骨化进行了蛋白组学研究报道，但仍没有找到能够阐明与胸椎黄韧带骨化发病的相关靶点蛋白。此次研究旨在通过同位素标记相对和绝对定量TMT(Tandem Mass Tag)联合液相色谱 - 串联质谱(LC-MS/MS)技术，将胸椎黄韧带骨化患者的骨化黄韧带和正常黄韧带进行比较，筛选出差异蛋白质，明确差异蛋白质功能，寻找胸椎黄韧带骨化发病相关靶点蛋白，为找到病因及发病机制提供理论依据。

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计差异蛋白鉴定及生物信息学分析。

1.2 时间及地点实验于2017 年10 月至2019 年5 月在遵义医科大学附属医院完成。

1.3 对象收集遵义医科大学附属医院胸椎黄韧带骨化患者3 例，2 例女性，1 例男性，年龄分别为50，52，58 岁。术前均签署知情同意书，并经遵义医科大学附属医院伦理委员会同意。

1.3.1 纳入标准术前通过体格检查、X 射线片、CT 和MRI确认了胸椎黄韧带骨化的诊断。

1.3.2 排除标准排除其他系统性病变或器质性病变。

1.4 材料 BCA 定量试剂盒(碧云天)；乙腈 (Merck)；Urea试剂盒、TMT 试剂盒(Thermo Fisher)；C18 分析柱(Thermo Fisher)；RP色谱柱(Waters)；Easy nLC 色谱系统 (Thermo Fisher)；Q Exactive plus 质谱仪 (Thermo Fisher)；分析软件：Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Fisher)。

1.5 方法

1.5.1 黄韧带标本组织采集与保存在脊柱外科手术期间，无菌获取骨化黄韧带和非骨化区正常黄韧带组织，小心剔除周围软组织，将附有血渍的标本用PBS 洗净，液氮固定30 min，保存在-80 ℃至使用。

1.5.2 蛋白质提取、定量将组织加入SDT 裂解液(4%SDS)，转移至 Lysing Matrix A 管中，用 MP 匀浆仪匀浆破碎2 次。超声处理后，沸水浴10 min。14 000 ×g离心15 min，取上清过滤，然后收集滤液。采用 BCA 法进行蛋白质浓度测定。将样品分装后冻存于-20 ℃。

1.5.3 FASP 酶解、TMT 标记各样品取 150 μg 蛋白质溶液，分别加入 DTT 至终浓度为 100 mmol/L，沸水浴 5 min，冷却至室温。加入200 μL UA buffer 混匀，转入 30 kD 超滤离心管中，12 500×g离心15 min，弃滤液(重复1 次)。加入100 μL IAA buffer，600 r/min 振荡 1 min，室温避光孵育30 min，离心12 500×g15 min。加入100 μL UA buffer 后以12 500×g离心15 min，重复2 次。加入100 μL 40 mmol/L NH4HCO3溶液，12 500×g离心1 min，重复2 次。加入40 μL Trypsin buffer，600 r/min 振荡1 min，37 ℃放置 16-18 h。换收集管，12 500×g离心15 min；再加入20 μL 40 mmol/L NH4HCO3溶液，12 500×g离心15 min，收集滤液。采用C18 Cartridge 对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液复溶，将A值设置到280 时进行肽段定量。各样品分别取100 μg 肽段，按照Thermo 公司TMT 标记试剂盒说明书进行标记。

1.5.4 Easy nLC 色谱每份样品采用纳升流速 Easy nLC 系统进行分离。缓冲液A 液为 0.1%甲酸水溶液，B 液为 0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为 80%)。色谱柱以 100%的A 液平衡，将样品上样到分析柱分离，流速为300 nL/min。使用2 h 梯度：0-5 min，B 液 6%；5-75 min，B 液线性梯度从6%-38%；75-85 min，B 液线性梯度从38%-100%； 85-90 min，B 液维持在100%。

1.5.5 质谱鉴定样品经色谱分离后用Q Exactive plus 质谱仪进行质谱分析。分析时长为 120 min，以正离子为检测方式，母离子扫描范围 350-1 800 m/z，一级质谱分辨率为 70 000，AGC target 为 3e6，一级Maximum IT 为 50 ms。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照此方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(MS2 scan)，MS2 Activation Type 为HCD，Isolation window 为2 m/z，二级质谱分辨率35 000，Microscans 为1，二级 Maximum IT 为 45 ms，Normalized Collision Energy 为30 eV。

文章来源：《中国组织工程研究》网址: http://www.zgzzgcyj.cn/qikandaodu/2021/0503/1455.html