基于电沉积原理的管状海藻酸钙水凝胶可控制备

近年来，随着生物医学和组织工程的高速发展，人工组织器官的体外构建能够有效解决异体组织器官移植中免疫排斥与供源不足的问题[1,2]。管状结构组织广泛存在于人体内部，起到连通整个人体组织和器官、运载氧气和营养物质的作用，是人体不可或缺的组成单元，为人体新陈代谢提供了必要的条件。

水凝胶是一种三维交联网络结构，具有与生物组织相似的特性，被广泛应用于药物和组织工程领域。其中海藻酸钙水凝胶因其含水量高、与细胞外基质结构类似，并且对细胞毒性低等优势，现被广泛用于包埋和固定细胞，进而用作体外构建三维结构支架。目前，研究者采用不同的方法制备了海藻酸钙水凝胶三维结构支架，如用喷嘴将海藻酸钠溶液快速注入氯化钙溶液中形成水凝胶纤维[3]；利用静电纺丝法通过堆叠技术形成含有不同细胞的多层水凝胶结构[4,5]；采用3D生物打印技术将细胞与水凝胶生物支架材料共同打印构建细胞-水凝胶生物微组织[6,7]；运用电沉积方法通过交联反应将细胞包埋在水凝胶中构建细胞-水凝胶生物支架[8,9]。前2种方法制备的海藻酸钙水凝胶形状结构简单，难以形成复杂的形状结构且无法控制海藻酸钙水凝胶的尺寸；3D打印技术虽能形成微观尺寸的水凝胶结构，但是需要液体材料3D打印平台，这极大地增加了实验成本。而电沉积方法具有实验材料易得、经济成本低及形成的水凝胶形状结构复杂、尺寸微小的优点，使得在制备海藻酸钙水凝胶生物微组织相关领域受到了越来越广泛的关注。然而，目前对电沉积方法制备管状水凝胶影响因素进行系统的研究较少，无法阐述说明电沉积参数在电沉积过程中的变化规律；另外，电沉积的参数控制存在盲目性，使得体外制备得到的管状结构水凝胶尺寸限制了氧气及营养物质的扩散距离，活细胞密度随着表面深度呈指数减少[10,11]。提高体外管状结构中活细胞密度关键在于精确控制管状结构三维尺寸。

本文采用电沉积方法，以海藻酸钠和CaCO3为电沉积原料，制备包埋细胞的管状海藻酸钙水凝胶，探讨直流电源电压、电沉积时间、海藻酸钠浓度及CaCO3浓度4种电沉积参数对水凝胶制备效果的影响，建立水凝胶直径生长模型，调整直流电源电压及电沉积时间来控制制备管状水凝胶直径尺寸，实验验证水凝胶直径生长模型的准确性及电沉积制备方法的可行性。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

海藻酸钠：黏度1.05～1.15 Pa·s,天津市福晨化学试剂厂；碳酸钙(CaCO3)、无水氯化钙(CaCl2)、氢氧化钠、无水乙醇、丙酮：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)：上海中乔新舟生物科技有限公司。

培养瓶：上海柏根生物科技有限公司；直流电源：LP305DE，深圳市乐达精密工具有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，邦西仪器科技(上海)有限公司；电子分析天平：JJ223BC，常熟市双杰测试仪器厂；生物光学显微镜(具有荧光功能)：OLYMPUS CKX53，广州市明美光电技术有限公司；铂线(Pt)、铜线：上海博翔电器仪表有限公司。

1.2 实验仪器消毒处理

为防止实验设备仪器被灰尘等杂质影响，造成细胞在培养过程中被污染，需要对实验仪器进行消毒处理。使用电子分析天平称取氢氧化钠20 g，采用定量移液管吸取丙酮5 mL和无水乙醇75 mL，加入到无菌培养瓶中配置成100 mL清洗液，用一次性棉片蘸少量清洗液擦拭铂线(Pt)、铜线、磁力搅拌器及直流电源表面，再使用75%医用消毒酒精擦拭实验仪器表面，最后用酒精棉片擦干置于超净台下用紫外线照射杀菌。

1.3 电沉积溶液制备

取10个75 cm2的无菌培养瓶分别装取50 mL超纯水，配制以下10组浓度不同的电沉积溶液。使用电子分析天平称取海藻酸钠粉末0.50 g及不同质量CaCO3粉末(0.15 g，0.20 g，0.25 g，0.30 g，0.35 g)、CaCO3粉末0.25 g及不同质量海藻酸钠粉末(0.30 g，0.40 g，0.50 g，0.60 g，0.70 g)分别加入10个无菌培养瓶并用玻璃棒搅拌。设置搅拌温度为37 ℃、搅拌速度为400 r/min、搅拌时间为24 h，将装有粉末试剂的无菌培养瓶固定在磁力搅拌器中，通过磁力进行均匀搅拌。粉末完全溶解后得到不同浓度的海藻酸钠与CaCO3的电沉积溶液。之后，取氢氧化钠粉末10 g加入到上述的电沉积溶液中，用玻璃棒搅拌均匀，调节溶液pH 为7.3。最后将配置好的电沉积溶液放在紫外线下照射15 min，保证其处于无菌状态，便于后面与Hepa1-6小鼠肝癌细胞混合。

1.4 氯化钙溶液制备